زراعة الأنسجة -Tissue Culture - 1

زراعة الأنسجة

Tissue Culture/1/

مقدمة :
يعتبر علم زراعة الأنسجة من المجالات الحديثة الهامة المنتمية حديثاً لعلم الوراثة وهو مجال تطبيقي سوف يحدث ثورة في مجال الزراعة حيث يهتم بتنمية أجراء صغيرة من الأنسجة النباتية Explantوالحيوانية يتراوح حجمها تقريباً بين عدة مليمترات إلي ما يقرب من البوصة في الطول علي بيئات صناعية معروفة المكونات وتحت ظروف بيئية متحكم فيها صناعياً ويتم هذا بغرض انقسام ونمو الخلايا وكذلك إعادة التشكل مرة أخرى في هذه الأنسجة لكي يتكون لدينا نمواً من الخلايا Callus أو كائن كامل ] نبات كامل [ ثم يتم نقله وأقلمته للظروف البيئية الزراعية وبذلك يعطي بعض النباتات أو الأصناف ذات مميزات خاصة يستفاد منها استفادة كبيرة في مجال الزراعة وهذا يتم إنجازه في جيل أو جيلين وبذلك لا نلجأ إلي برامج التربية التقليدية التي قد تستغرق من 10 - 15 عام .

وتعتبر الظروف البيئية التي يتعرض لها النسيج من أهم العوامل التي تؤثر علي نجاح عمليات زراعة الأنسجة وهذه الظروف مثل الضوء ( شدته - مدة التعرض له - موجاته ) ودرجة الحرارة ( هل هي ثابتة أو متغيرة حسب الليل والنهار ) والرطوبة ( ملائمة فلا تساعد علي نمو الكائنات الدقيقة وكذلك لا تساعد علي سرعة جفاف البيئة ) .

ولقد حقق المتخصصون في هذا المجال تقدم كبير في زراعة الأنسجة النباتية لما تمتاز به الخلايا النباتية من قدرة علي إعادة الشكل مرة أخرى .

لكن التقدم في مجال زراعة الأنسجة الحيوانية يواجه بعض الصعوبات حيث أن الخلايا الحيوانية ليست لها القدرة علي إعادة الشكل مرة أخرى .

تعريف علم زراعة الأنسجة :

يقصد بزراعة الأنسجة هو استخدام جزء من النبات قد يكون البذرة أو جزء من الجذر أو جزء من الساق أو جزء من الأوراق أو المتك أو حبوب اللقاح علي بيئة مغذية غالباً ما تحتوي علي العناصر الكبرى والصغرى ومصدر للسكريات وغالباً ما يستخدم السكروز كبيئة مغذية وأحياناً تضاف بعض من منظمات النمو مثل الأكسينات لتشجيع تكوين الجذور ونموها والسيتكوينيتات لتشجيع نمو الساق والهرمونات التي توجه النبات لتكوين نسيج Callus وهو عبارة عن مجموعة من خلايا منتظمة أو غير منتظمة ونعني بكلمة منتظمة أي أنها خلايا متشابهة لا يمكن تمييز خلايا خاصة بالجذر أو الساق أو الأوراق - وزراعة تلك الخلايا المفككة علي بيئة مغذية يمكن الحصول علي أفراد تشبه النبات الأم الأصلي في تركيبها الوراثي بكميات كبيرة في أوقات قصيرة .

وتتمم هذه الطريقة في ظروف تعقيمية حيث أن البيئات المستخدمة تكون موطن خصب للكائنات الدقيقة .

أهداف استخدام زراعة الأنسجة :

1 - Rapid clone - Propagation

إكثار النباتات خلال مزارع الأنسجة يمكن أن يحقق :

أ - True - to - type :

النباتات المنتجة من نشاط القمم المرستيمية تكون من الناحية الوراثية مطابقة تماماً للنسيج الأم المأخوذة منه القمم المرستيمية مما يؤدي إلي المحافظة علي الصفات الوراثية - وإنتاج نباتات بهذه الكيفية إحدى مميزات التكاثر الخضري للمحافظة علي السلالات .

" Clone " والسلالة :- هي النباتات الناتجة بدون تغير وراثي من فرد بمعني أنها سلالة من نبات واحد دون تغير في الصفات الوراثية أي أن جميع النباتات متشابهة وراثياً .

ب - Rapid :

بمعني سريع … فترة كل خطوة من خطوات زراعة الأنسجة تتراوح من 4- 6 أسابيع فقط .

جـ - Mass production :

بمعني إنتاج أعداد كبيرة في فترة قصيرة .

2-تبادل وحفظ التراكيب الوراثية ( الأنواع ) :

Germplasm Storage and exchange

أ - يمكن خلال زراعة الأنسجة تبادل الأصناف الجديدة والقديمة بين الدول دون الخوف من انتشار الأمراض من الدول المصدرة إلي الدول المستوردة فمثلاً ظهور صنف جديد في منطقة أو دولة ما قد تقف إجراءات الحجر الزراعي والخوف من انتشار الأمراض عائقاً في سبيل نشر هذا الصنف ولكن عن طريق زراعة الأنسجة يمكن التغلب علي هذا العائق .

ب - حفظ التراكيب الوراثية يعتبر هدف عظيم بالنسبة لعلماء التربية حيث يمكنه حفظ أنواع معينة أو أصناف معينة في أنابيب تحفظ في ثلاجات لإيقاف نموها حتى يحتاج إليها في عمليات التربية والتهجين المختلفة وذلك بدلاً من زراعتها في الحقل مباشرةً والمحافظة عليها في الحقل الذي يتطلب كثيراً من الوقت والجهد فضلا عن إمكانية فقدها في أي لحظة بسبب الظروف البيئية والحيوية في الحقل .

إنتاج نباتات خالية من مسببات الأمراض خاصة الفيروسية منها :

Production of pathogens [mainly virus] - free plants

من المعروف أن بعض النباتات التي يتم إكثارها خضرياً تكون عرضة للإصابة بالأمراض الفيروسية والتي تنتقل من خلال وسائل الإكثار ومن أهم الأمثلة :- البطاطا - الثوم - الفراولة - وغيرها . لذلك فمن خلال مزارع الأنسجة يتمم زراعة جزء صغير جداً 0.2 - 0.5 ملليمتر . هذا الجزء غالباً خالي من الفيروس حتى في النباتات المصابة بالفيروس لعدم احتوائه علي أوعية vesseless وبطئ حركة الفيروس في المنطقة النشطة . النباتات الناتجة من هذا الجزء هي نباتات خالية من مسببات الأمراض وبذلك يمكن توفير ملايين الدولارات التي تستخدم في استيراد شتلات من مناطق باردة حيث لا ينمو الفيروس .

إنتاج العديد من المركبات العضوية والأمصال :

Pharmacology, Vaccines

كثير من النباتات الطبية والعطرية تنتج مواد عضوية ذات أهمية خاصة طبية وصناعية مثل :

الداتورا - السكران - الريحان - النعناع .

يزرع أجزاء منها لإنتاج نسيج الكالوس CALLUS الذي نستخلص منه المادة الفعالة بدلاً من اللجوء إلي زراعة النبات .

نسيج الكالوس

مثال :إنتاج الكاكاو معملياً

تستخدم مزارع الأنسجة في إنتاج العديد من الأمصال Vaccines بنفس الأسلوب .

مكونات معمل زراعة الأنسجة :

يتكون معمل زراعة الأنسجة من 4 حجرات هي :

1 - حجرة المطبخ Kitchen area :

تتم في هذه الغرفة غسيل جميع الأدوات المستخدمة في هذه الأنسجة مثل الزجاجات , أطباق بتري , المخابير , الماصات وغيرها من الأدوات الزجاجية حيث تغسل بالماء ( ماء مقطر مرتين ) D.D.W فقط ولا يستخدم الصابون مطلقاً .

2 - حجرة الزراعة Cultivation Room :

ويتم في هذه الغرفة زراعة الخلايا أو الأنسجة أو الأعضاء في البيئات .

3 - حجرة النمو Growth Room :

يتم في هذه الحجرة نمو الأجزاء المزروعة في البيئات ويجب توفر الظروف التالية في هذه الحجرة :-

حرارة 25 ْ م

ضوء 16 ساعة ضوء فلورسنت أبيض وذلك لأنه يوجد به جميع أطوال موجات الضوء كما أنه لا يؤدي إلي ارتفاع درجة الحرارة .

4 - حجرة التفريد Mist Room :

في هذه الحجرة يتم تفريد النباتات النامية من الزجاجات أو أطباق تيري في بيت موسى أو تربة معقمة تماماً تحت ظروف متحكم فيها .

وبعد ذلك تجرى له عملية أقلمة ثم ينقل إلي الصوبة أو إلي الأرض المستديمة مباشرةً .

وعملية التفريد هذه تكسب النباتات النامية القوة والتحمل للظروف الطبيعية كي تستطيع الاستمرار في الحياة عند نقلها إلي التربة .

طرق نقل النباتات المزروعة :

1 - نضع الأصيص في صوبة حتي يصبح متأقلم ونعمل علي رش رزاز متقطع لمدة أسبوع

2 - ننكس إناء زجاجي علي الأصيص في اليوم الأول يكون الإناء محكم وبعد مرور 24 ساعة نرفع الغطاء فترة وجيزة ثم نعيد تنكيسه وهكذا وفي كل مرة نزود فترة رفع الغطاء حتى يتأقلم النبات .

الظواهر المصاحبة لعملية الأقلمة :

نتيجة عملية الأقلمة تحدث العديد من التغيرات الكيميائية والفسيولوجية والمورفولوجية

أولاً التغيرات الكيميائية والفسيولوجية :
1 - زيادة نسبة الماء المرتبط غير الحر .

2 - زيادة نسبة السكر المختزل وغير المختزل وقلة النشا .

3- تحول البروتينات إلي أحماض أمينية .

ثانياً التغيرات المورفولوجية :

- زيادة الطبقة الشمعية علي الأوراق للحماية من البرودة .

- القوام الجلدي للأوراق .

- نقص الحجم , حجم الأوراق يقل .

- زيادة نسبة المادة الجافة .

- قلة نسبة الماء القابلة للتجمد نتيجة ارتفاع الضغط الأسموزي .

الأجزاء النباتية المستخدمة في زراعة الأنسجة Explants :

تتنوع الأجزاء النباتية المستعملة في زراعة الأنسجة وذلك علي حسب :

نوع النبات - هدف الدراسة .

فقد نستخدم :

القمم النامية للبراعم - الجذور - أي جزء من الورقة - برعم جانبي - جزء من الحزم الوعائية للجذور - أو يتم استخدام المتك أو حبوب اللقاح المعزولة أو الأجنة المعزولة عقب التلقيح والإخصاب أو نستخدم البويضات أو المبيض كله وما يحمله من بويضات بعد إزالة أغلفة المبيض .

ويشترط في الجزء النباتي المستخدم :- قدرته علي الانقسام الميتوزي حيث يعتبر اختبار الجزء النباتي المستعمل وكذلك مرحلة نمو هذا الجزء ذات أهمية كبيرة في زراعة الأنسجة وفي جميع الأحوال يجب تعقيم الجزء النباتي المستخدم قبل البدء في زراعة الأنسجة ومن أبسط الطرق المستخدمة في التعقيم هي غمس النسيج في كحول لعدد قليل من الثواني ثم يعامل بمحلول كلوراكس 5 - 15 % لمدة 5 - 20 دقيقة .

طرق التعقيم في زراعة الأنسجة :

تختلف طريقة التعقيم حسب الجزء المراد تعقيمه كالتالي :

1 - يتم تعقيم المعمل كلياً بالفورمالين .

2 - يتم تعقيم الأدوات الزجاجية والمعدنية علي درجة حرارة 160 ْ م لمدة 4 ساعات في الاوتوكلاف .

أو في الفرن مباشرةً علي درجة 200 ْم لمدة 4 - 24 ساعة .

3 - يتم تعقيم البيئة في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْم وضغط 15 ضغط جوي لمدة 15 دقيقة .

ولا يمكن تعقيم البيئة في الفرن مباشرةً لعد وجود ضغط به حيث أن الضغط هو الذي يقوم بالتعقيم وقتل الميكروبات وليست الحرارة .

الهرمونات ومنظمات النمو يتم تعقيمها بواسطة المرشحات وهي لها أشكال وطرق مختلفة في التعقيم :-

فبعض منها عبارة عن إناء زجاج من أعلى ومن أسفل إناء آخر وبالمنتصف المرشح حيث يتم وضع الهرمونات أو منظمات النمو أعلى فيحدث لها ترشيح وفصل الميكروبات خلال المرشح ثم تتجمع في الإناء السفلي .

الأجزاء النباتية :

يتم تعقيمها بالكلوراكس ( هيبو كلورات صوديوم ) 5 % لمدة 15-20 دقيقة .

أو بتركيز 10 % - 20 % لمدة 10 - 30 دقيقة . أو باستخدام الكحول 70 % لمدة 1 - 5 دقائق

أو باستخدام الكحول المطلق 90 % لمدة ثواني ثم الغسيل بالماء المقطر مرتين عدد 2 - 3 مرات .

البذور :- يتم تعقيمها بنترات الفضة أو محلول السليماني .

ملحوظة :-

يمكن استخدام المضادات الحيوية عندما يكون النبات مصاباً من الداخل كوسيلة للتعقيم ويكون النبات المصاب هام جداً فيستخدم المضادات الحيوية مثل الأبسيمين واسع المفعول ومدى استخدامه 50 - 150 ميكروجرام /مم3 .

تجهيز معمل زراعة الأنسجة :
يجب توفير الأجهزة التالية في معمل زراعة الأنسجة :
1 - جهاز تقطير الماء :
الماء المستخدم في زراعة الأنسجة لابد أن يكون مقطر مرتين Double destile water ويمكن الحصول عليه من جهاز تقطير الماء مرتين وقوته 200.000 أوم / ساعة .
شروط الماء المستخدم في زراعة الأنسجة :-
1 - خالي من الشوائب حتى لا يحدث تلوث للبيئة .
2 - خالي من الأملاح المعدنية حتى لا يؤدي ذلك لتغير pH البيئة وبالتالي تصبح سامة للنبات .
3 - أن يكون الماء مقطر مرتين D.D.W .
وعن طريق جهاز وهو عبارة عن عمود من الراتنجات به شحنة موجبة وأخرى سالبة وذلك لجذب الأملاح الموجودة في الماء وبالتالي تقطيره أو عن طريق الأسموزية وهو عبارة عن غشاء يوضع بداخل أسطوانة يوجد بخارجها تركيز عالي وبداخلها تركيز منخفض فيتم بذلك الاتحاد مع الأملاح التي توجد بالماء وبالتالي تقطيره .
وتعد الطريقة الأولي أكثر الطرق استخداماً وأفضلها .
ملحوظة :-
يمكن استخدام ماء الأمطار في زراعة الأنسجة .
2 - الميزان :-
يجب توفير ميزان بمعمل زراعة الأنسجة وأن تكون حساسية الميزان
2 -5 مليجرام ويزن حتى 50 جرام أي حساسية الميزان حتي الرقم العشري الثالث .
3 - جهاز لضبط ال pH :- pH Meter :-
حيث انه لابد أن يكون pH البيئة المستخدمة يتراوح من 5.5 - 5.8 ويجب أن تكون حساسية الجهاز 1.4 P.P.m
ويستخدم لضبط pH البيئة محلول Hcl مخفف ( 1ع ) لخفض ال pH عندما يكون الوسط قلوي .
ويضاف KOH لرفع ال PH عندما يكون الوسط حامضي .
[COLOR=#0000ff]ملحوظة :- [/COLOR]
تستخدم KOH بدلاً من NaOH حتى يستفيد النبات من عنصر البوتاسيوم كما أنه عنصر غير سام بالنسبة للنبات .
4 - جهاز سخان ومقلب :-
يستخدم السخان لتسيح أو لانصهار الآجار في حالة البيئات الصلبة حتى يسهل صبه ويستخدم المقلب في إذابة المحاليل وهو عبارة عن مغناطيس يمكن استخدامه أيضاً في تقليب الآجار حتى لا يلتصق ويأخذ اللون الأسود , وكذلك في إذابة المحاليل والكيماويات ويستخدم أيضاً في تقليل التلوث الموجود علي الأجزاء النباتية .
5- أجهزة تنظيف الأجزاء النباتية :
تتم عملية تنظيف الأجزاء النباتية بإحدى الطرق التالية :
أ - وضع الأجزاء النباتية في كأس وتغطيته بشاش أو سلك وفتح الصنبور عليه .
ب - عن طريق استخدام المقلب .
جـ - عن طريق إحداث موجات فوق صوتية تحدث ذبذبات شديدة الأجزاء النباتية وبالتالي تنظيفها .
د - عن طريق غمس الأجزاء النباتية في الكحول 95 % لمدة ثواني ثم وضعها في محلول كلوراكس 15 % لمدة 15 دقيقة وبعد ذلك توضع في ماء مقطر ثلاث مرات للتخلص من أثر الكلوراكس .
6- أجهزة صب البيئة :
تستخدم هذه الأجهزة في صب البيئة في أطباق بتري أو الزجاجات التي يتم الزراعة فيها وتختلف هذه الأجهزة عن بعضها ويوجد منها عدة أشكال :-
أ - أحد هذه الأجهزة عبارة عن حقنة زجاجية كبيرة مدرجة تنتهي هذه الحقنة بخرطومين أحدهما لشفط البيئة والأخرى لصبها في الأطباق وذلك علي حسب الحجم المطلوب .
ب - يوجد جهاز كهربائي لصب البيئة وهو ينتهي أيضاً بخرطومين أحدهما لشفط البيئة والآخر لصبها في الأطباق ويتم التحكم في الحجم المطلوب وجوده ميكانيكياً .
7- أجهزة تعقيم البيئة :
يتم تعقيم البيئة في الأوتوكلاف علي درجة حرارة 121 ْ م وتحت ضغط جوي 15 ض. ج 15 Psi لمدة 15 دقيقة .
8- الهزاز الدائري :
يستخدم الهزاز الدائري في الاستعمالات التالية :
أ - الزراعة المائية مثل زراعة الجذور والأقراص الورقية .
ب - فصل الخلايا من الكالوس بوضعه في محلول مائي .
جـ - زراعة الخلايا علي الميكروفيلم في البيئة المائية .
يستخدم هذا الجهاز في حدود 100 R . B .Y
9 - آلة غسيل الأدوات :- Dishwasher :-
يتم فيها غسيل معظم الأدوات الزجاجية مثل أطباق يتري , الماصات , المخابير , الزجاجات , وغيرها من الأدوات الزجاجية المعدنية .
ويستعمل في الغسيل ماء مقطر مرتين ولا يستخدم الصابون مطلقاً .
10 - الثلاجة :
وتستخدم الثلاجة في تخزين البيئات , الكيماويات , المحاليل المغذية , ويفضل وجود حجرة كاملة للتخزين .
11 - ميكروسكوب :- Microscope :
وهو يستخدم في حالات نادرة مثل انصهار البروتوبلاست ويستخدم أيضاً لفحص الخلايا والأنسجة .
12 - الهود :- Transfer Hood :
وهو المكان التي تتم فيه زراعة الأجزاء النباتية ويجب أن يكون معقم 100% .
13 - الأرفف :- Shelves :
يستخدم الأرفف في وضع الأدوات عليها مثل الأدوات الزجاجية والمعدنية .
14 - فرن :
وذلك لتجفيف الأوعية والزجاجات وتعقيمها علي درجة 200 ْ م
لمدة 4 -24 ساعة .
15 - الأدوات الزجاجية والمعدنية :
دوارق مخروطية بأحجام مختلفة
دوارق معيارية بأحجام مختلفة
مخابير مدرجة بأحجام مختلفة
ماصات مدرجة بأحجام مختلفة
أطباق بتري , وزجاجات بأحجام مختلفة للزراعة فيها .
ملاقط كبيرة ذات أطراف غير حادة للزراعة .
ملاقط ذات أطراف حادة لنزع بشرة الأوراق .
ابر تشريح .

هناك بعض الأمور الهامة التي يجب أن تؤخذ في الاعتبار عند المعمل في مجال زراعة الأنسجة :
1 - يجب عدم تقريب الكحول من اللهب لأنه سريع الاشتعال .
2 - يجب عدم استنشاق هيبوكلوريد الصوديوم لأنه سام جداً .
3 - يحظر عدم إطالة النظر إلي لمبة Ultraviolet لأنها تسبب العمى .
4 - الاحتراس عند التعقيم بمحلول السليماني لأنه شديد السمية .
يجب الاحتراس عند استعمال الكيماويات لأنها شديدة السمية .
ينصح بغسيل الأسطح غسيلاً جيداً بالكحول 70 % أكثر من مرة وذلك لتقليل التلوث .
بنصح بأن تكون الملابس التي يرتديها من يقوم بالزراعة نظيفة لتقليل التلوث .
يجب تعقيم المعمل كله تعقيماً جيداً لضمان خلوه من الميكمروبات قبل بدء العمل .
تعقيم الأدوات المعدنية بالكحول وتعريضها للهب حتى الاحمرار لتقليل أي ميكروبات توجد عليها .
تعقيم الهود جيداً قبل الزراعة .
أن يكون الماء المستعمل في زراعة الأنسجة مقطر مرتين ومعقم حتى نضمن خلوه من الميكروبات والأملاح .
تعقيم الأيدي باستمرار أثناء الزراعة لضمان التعقيم التام .
ينصح باختبار الهود قبل الزراعة فيه للتأكد من خلوه من التلوث .
التأكد من التعقيم التام لأدوات الزراعة والبيئات والأجزاء النباتية المستخدمة في الزراعة لضمان نجاح العمل .
بنصح بعدم التحدث أثناء الزراعة تجنباً للتلوث .
ينصح بعد إمرار الأيدي فوق مكان الزراعة تجنباً للتلوث .
كيفية اختبار التلوث الموجود في الهود :
لمعرفة مدى نظافة الهود وملاءمته للزراعة به نضع بداخله عدد من أطباق تيري بكل منها بيئة مغذية وتوزع الأطباق في أماكن مختلفة من الهود ونتركها لفترة معينة ثم نكشف عنها لمعرفة وتقدير مدي تلوث البيئات بكل طريق .